E. coli’s tryptophan attenuator – er der noget, vi ikke ved?

Main area:Molecular biology
Target group:Biology, Biochemistry, Molecular Biomedicine
Educational level:Bachelor, Outside course scope
Project description:

Den elegante attenuerings-mekanisme, der styrer syntesen af E. coli’s tryptophan biosyntese enzymer, er lærebogs stof. Den virker ved, at mRNA umiddelbart foran trp-generne kan antage alternative strukturer afhængigt af, om ribosomerne er bremset ved to foregående trp-codon i leader peptidet eller ej, hvilket igen er afhængigt af tryptofan koncentrationen i mediet. Den struktur som understøtter transkription af trp generne dannes kun når ribosomet bremses ved de to trp codons. Som følge af denne reguleringsmekanisme udtrykker E. coli kun tryptophan biosyntese enzymerne, når der er mangel på tryptophan i cellen.

Problemet er, at man ved, at RNA-polymerasen og det første ribosom på mRNA bindes sammen af en bro – NusG proteinet i prokaryote celler.

Når det første ribosom bliver bremset på de to trp-codons ved trp mangel, skulle RNA-polymerasen via NusG broen også blive bremset. Derfor er der, så vidt vi kan se, kun to muligheder for, hvordan den ellers velbeskrevne reguleringsmekanisme kan virke.

1)  Den første er at mRNA spooler ud mellem RNA-polymerasen og det første ribosom, og derfor kan antage den struktur, der er nævnt i lærebøgerne ved trp mangel.

Transcriptions-initieringsprocessen for RNA er sådan at sigma-faktoren sidder på RNA-polymerasen når denne sidder på promotoren. Sigma falder af kort efter at RNA-polymerasen er begyndt transcriptionen. Først derefter er der plads til, at NusG kan binde.

2)  Den anden mulighed er derfor, at attenuerings-mekanismen kun kan virke i det tidsrum, hvor NusG broen endnu ikke er etableret. Dette kunne passe med at alle attenuator-sekvenser for biosyntesen af de syv aminosyrer, der er styret på denne måde ligger umiddelbart efter promotoren. Der er endda nogle, der mener, at det at det første ribosom hiver i mRNA medvirker til at RNA-polymerasen overhovedet kan gå fremad, hvilket ville tale imod mekanisme 1).

Det vides at NusG proteinet følger RNA polymerasen gennem en poly-cistronisk operon.

Det forsøg, vi havde tænkt os skulle skelne mellem de to mekanismer, er i al sin enkelthed at gøre trp-attenuerings-sekvensen til gen nr 2 i operonen, således at NusG er på plads, når RNA-polymerasen kommer til trp-attenuatoren. Mekanisme 2) skulle herved være vanskeliggjort.

Mere specifikt kunne forsøget være at lave en hybrid-operon mellem araB og en trp-lac operon og derefter måle om syntesen af LacZ enzymet, der er nemt at måle, svarer på tryptofan mangel som beskrevet i lærebogen. Projektet omfatter en del PCR og kloningsarbejde samt enzym målinger.

Hvis du er interesseret henvend dig da til Sine Svenningsen sls@bio.ku.dk eller Steen Pedersen (emeritus)  steenp@bio.ku.dk, som vil være den daglige vejleder, men som formelt ikke kan være hovedvejleder.

Methods used:kloning, PCR, enzymassays
Keywords:bakteriegenetik, transkriptionsregulering, translation
Supervisor(s): Steen Pedersen og Sine Lo Svenningsen
Email:steenp@bio.ku.dk