Codonbrug og betydningen af hurtigt-translaterede codons for transkription, translation og mRNA stabilitet

Hovedområde:Molecular Microbiology
 
Målgruppe:Biology, Biochemistry, Molecular Biomedicine
 
Niveau:Bachelor
 
Projektbeskrivelse:
Steen Pedersen, lektor emeritus og Sine Lo Svenningsen udbyder et projekt til én evt to biologi/biokemi studerende til start nu eller senere efter nærmere aftale. Henvendelse til steenp@fastmail.com eller på tlf 22 39 05 14. Baggrund. Synonyme codon koder for den samme aminosyre, men gør det ofte med forskellig translationshastighed. Codonbrugen er forskellig i højt og lavt ekspresserede gener og også internt i generne. De codon, der er overrepræsenteret i de højt ekspresserede gener, translateres i gennemsnit ca. dobbelt så hurtigt som de øvrige og der er en overvægt af de langsomt translaterede codon i begyndelsen af alle naturlige bakterielle gener. At have langsomme codon i starten af gener er evolutionært konserveret og brugen af disse må derfor have en funktion. Ved at indsætte serier af hurtige codon i starten af et gen har vi opdaget dels en op til 10 ganges nedsættelse af mRNA’s levetid og dels at op til 9 ud af 10 RNA polymeraser terminerer og altså ikke giver normal mængde mRNA for genet eller for de senere gener i operonen. Da ribosomet er det eneste makromolekyle i cellen, som læser codon, antager vi, at transkriptionstermineringen skyldes at den normale interaktion mellem der første ribosom på mRNA og RNA polymerasen ikke er etableret på grund af de hurtigt translaterede codons. Projektet vil belyse en model for transkriptions termineringen når RNA polymerasen udsættes for at skulle danne hurtige codons i begyndelsen af lacZ genet fra E.coli. Lidt afhængigt af projektets fremdrift inden projektets start vil metoderne omfatte: Design af primere til PCR, PCR reaktioner, “in fusion” kloning eller evt kloning ved “recombineering” samt enzym målinger af første og sidste genprodukt fra lac-operonen dvs LacZ enzymet beta-galactosidase og LacA enzymet lactose transacetylase. Læs eventuelt Pedersen S, et al. 2019 J. of Molecular Biology. doi:10.1016/j.jmb.2019.01.026. Fast Translation within the First 45 Codons Decreases mRNA Stability and Increases Premature Transcription Termination in E. coli. Artiklen har følgende Abstract We show here that the specific use of fast or slowly translated codons in the early coding region of a gene may influence both the mRNA stability and premature transcription termination. We first inserted a pair of nearly identical 42-base-pair (bp)-long sequences into codon 3 of the Escherichia coli lacZ gene. The only difference between the two inserts was that the first base in one was moved to become the last base in the other, providing a difference in the reading frame, one of which had the biased codons typical for ribosomal protein genes and which previously was shown to be faster translated than average. This insert reduced the mRNA stability and increased premature transcription termination and together resulted in a hundred-fold difference in lacZ expression. We next generated lacZ variants with 7, 14 or 21 fast translated, ribosomal-type codons inserted into codon 13 of lacZ. This gave progressively more unstable mRNAs and also progressively increased transcription termination up to 90%. By modeling, based on estimates of the translation rate of individual codons, we can explain these observations by an increased susceptibility of the mRNA to degradation, determined by the length and degree of the early mRNA being uncovered by ribosomes. Thus, we suggest that the translation rate differences among the synonymous codons early in a gene enable a "velocity code" within the amino acid coding ability, where the translation rate differences encode the mRNA stability and the premature termination of the RNA polymerase.
 
Anvendte metoder:cloning, recombineering, PCR, reporter gene fusions
 
Keywords:protein syntese, translation, transkriptions terminering, regulering af gen ekspression
 
Vejleder(e): Steen Pedersen, Sine Lo Svenningsen
 
E-mail:steenp@fastmail.com